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农业种植菌种的保藏方法

 菌种保藏的具体方法很多,原理却大同小异。首先要挑选典型菌种(type culture)的优良纯种,最好采用它们的休眠体(如分生孢子、芽孢等);其次,还要创造一个适合其长期休眠的环境条件,诸如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。   水分对生化反应和一切生命活动至关重要,因此,干燥尤其是深度干燥,在保藏中占有首要地位就不言而喻了。五氧化二磷、无水氯化钙和硅胶是良好的干燥剂,当然,高度真空还可同时达到驱氧和深度干燥的双重目的。

   除水分外,低温乃是保藏中的另一重要条件。微生物生长的温度低限约在-30℃,可是,在水溶液中能进行酶促反应的温度低限则在-140℃左右。这或许就是为什么在有水分的条件下,即使把微生物保藏在较低的温度下,还是难以较长期地保藏它们的一个主要原因。在低温保藏中,细胞体积较大者一般要比较小者对低温更为敏感,而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因同低温会使细胞内的水分形成冰晶,从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤有关。如果放到低温(不是一般冰箱)下进行冷冻时,适当采用速冻的方法,可因产生的冰晶小而可减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时,冰晶又会长大,故快速升温也可减少对细胞的损伤。当然,不同微生物的最适冷冻速度和升温速度也是不同的。例如,酵母的冷冻速度以每分钟10℃为宜,而红细胞则相应地为2000℃。冷冻时的介质对细胞损伤与否也有显著的影响。例如,0.5mol/L左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞,并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞;大分子物质如糊精、血清白蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)虽不能透入细胞,但可能是通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。在实践中,发现用较低的温度进行保藏时效果更为理想,如液氮温度(-195℃)比干冰温度(-70℃)好,-70℃又比-20℃好,而-20℃则比4℃好。   一种良好的保藏方法,首先应能保持原菌的优良性状不变,同时还须考虑方法的通用性和操作的简便性。具体的菌种保藏方法很多,其原理和应用范围各有侧重,优缺点也有所差别。

   在国际著名的美国ATCC(American Type Culture Collection)中,目前已改为仅采用两种最有效的方法,即保藏期一般达5~15年的冷冻干燥保藏法和保藏期一般达20年以上的液氮保藏法,以达到最大限度地减少传代次数和避免菌种衰退的目的。

   保藏原理是这样的:当菌种保藏单位收到合适菌种时,先将原种制成若干液氮保藏管作为保藏菌种,然后再制一批冷冻干燥保藏菌种作为分发用。经5年后,假定第一代(原种)的冷冻干燥保藏菌种已分发完毕,就再打开一瓶液氮保藏原种,这样下去,至少在20年内,凡获得该菌种的用户,至多只是原种的第二代,可以保证所保藏和分发菌种的原有性状。


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